Završio je Srednju glumačku školu u Novom Sadu, a kasnije se upisao na Kazališnu akademiju Sveučilišta u Zagrebu.
Na filmu je debitovao 1960. godine u filmu Francea Štiglica Deveti krug, s tematikom holokausta. Glumio je mladića koji za vreme rata pokušava spasiti mladu Jevrejku oženivši se njome. Nakon filma stekao je veliku popularnost, koju potom učvršćuje igrajući savremene likove u komedijama Martin u oblacima (1961) i Prekobrojna (1962) Branka Bauera. Ovo je načinilo od Borisa Dvornika jednu od velikih zvezda kinematografije bivše Jugoslavije i stavilo ga u donelo slavu sličnoj koju su imali Ljubiša Samardžić, Milena Dravić i Velimir Bata Živojinović.
Do sredine 1960-ih godina Dvornik je nastupao uglavnom u komedijama, a od 1966. godine počinje se sa velikim uspehom pojavljivati i u filmovima s tematikom iz Narodnooslobodilačkog rata. Za uloge u filmovima Most (Hajrudin Krvavac, 1969) i Kad čuješ zvona (Antun Vrdoljak, 1969) nagrađen je Zlatnom arenom na festivalu u Puli. Za ulogu u ratnom filmu U gori raste zelen bor (Antun Vrdoljak, 1971) i za ulogu šofera-zavodnika u Opkladi (Zdravko Randić, 1971.) osvojio je Srebrnu arenu. Nastupio je u više od 40 dugometražnih igranih filmova (neretko je nastupao i u kratkometražnim), u mnogim televizijskim dramama i u više televizijskih serija.
Zenit popularnosti Borisa Dvornika je došao 1970-ih ulogom Roka Prča u kultnoj seriji "Naše malo misto", a potom i ulogom brijača Meštra u seriji "Velo misto". Nakon što je stekao status jednog od napriznatijih glumaca bivše Jugoslavije, Boris Dvornik uglavnom je radio u Hrvatskom narodnom kazalištu u svom rodnom Splitu.
Boris Dvornik je umro 24. marta 2008. u svom splitskom domu od srčanog udara. Sahranjen je tri dana kasnije na groblju Lovrinac, u prisustvu više hiljada ljudi.
Imao je dva sina - Dina i Deana Dvornika.